Calcein AM/PI Double Stain Kit 活細胞/死細胞雙染試劑盒

產品關鍵詞：
Calcein, AM 鈣黃綠素AM；Propidium Iodide (PI) 典化丙啶；Live/Dead Cell Double Staining Kit 活細胞/死細胞雙染色試劑盒；SYTOX Red Dead Cell Stain 死細胞染色；溴乙啡錠二聚體（EthD-1）；CAS NO：148504-34-1；

產品信息

【溫馨提示】：見我司懋康生物（maokangbio）整理的鈣黃綠素（Calcein）系列產品專題。
【溫馨提示】：見我司懋康生物（maokangbio）整理的鈣黃綠素AM（Calcein AM），超純級別，50μg特殊包裝，單個產品信息。

試劑盒組分

產品描述

本鈣黃綠素AM/典化丙啶雙染試劑盒(Calcein AM/PI Double Stain Kit)，包含鈣黃綠素AM和典化丙啶兩種熒光染料，用于對活細胞和死細胞的同時染色，即是常稱的活細胞/死細胞雙染試劑盒（Live/Dead Cell Double Staining Kit）。

試劑盒工作原理在于：Calcein AM（鈣黃綠素乙酰甲酯），CAS NO：148504-34-1，一種具高度親脂性和細胞膜滲透性的活細胞熒光染料。本身不具熒光，一旦進入細胞后，被細胞內酯酶水解生成鈣黃綠素（calcein），產生亮綠色熒光（Ex/Em= 490nm/515nm）。因此，Calcein AM僅對活細胞進行染色。另一方面，典化丙啶（PI），一種細胞核染料，不能穿透完整的活細胞膜。只能穿透死細胞的不規則區域進入細胞核，然后嵌入DNA雙螺旋區域，產生紅色熒光（Ex/Em= 535nm/617nm）。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激發，因此可用熒光顯微鏡同時觀察活細胞和死細胞。而用545 nm激發，僅可觀察到死細胞。結合這些特點，Calcein, AM和PI經常被結合用作活細胞和死細胞的雙重染色。

測定方法與結果呈現
1）   熒光顯微鏡（Fluorescent Microscopy）
檢測方法：490±10 nm激發能同時看到呈黃-綠色熒光的活細胞和紅色的死細胞。另，545nm激發可能只能看到呈紅色的死細胞。
 
Fig 1. Fluorescence microscopy images of calcein-AM (green) and propidium iodide (red). The macrophages differentiated into osteoclasts on (a) nt-TiO2 and (b) nt-TiO2-P for 4 days. Cells were then examined by fluorescence microscopy (Axioplan 2, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) with 490-nm excitation for the simultaneous monitoring of viable and dead cells. [Reference: Tae-Hyung Koo et al. Immobilization of pamidronic acids on the nanotube surface of titanium discs and their interaction with bone cells. Nanoscale Res Lett. 2013; 8(1): 124.]

2）  熒光酶標儀（Fluorescent Plate Reader）
檢測方法：96孔透明底的黑色酶標板（96-well black plate with clear bottom），Calcein檢測的激發波長為490nm，發射波長為520nm；PI檢測的激發波長為530nm，發射波長為617nm；
 
Fig 2. HeLa cells were seeded at 1,500 to 100,000 cells/well in a 96-well black plate with clear bottom and incubated overnight. Cells were exposed to Triton X-100 (0.05%, 10 min) and cell viability/toxicity was measured using Calcein AM-PI double stain kit. Relative fluorescence for Calcein AM (left) and Propidium Iodide (right) are shown.

3）  流式細胞儀（Flow cytometer）
檢測方法：流式細胞儀，Calcein檢測的激發/發射波長為488/535nm，PI的激發和發射波長為488/620nm。
  
Fig 3. Quantification of calcein and PI staining in WT cells and in cells incubated with increasing concentrations of miltefosine: 20μM, 40μM or 100μM for 24h. [Reference: Basmaciyan L et al. Calcein+/PI- as an early apoptotic feature in Leishmania. PLoS One. 2017 Nov 7;12(11):e0187756.]

注意事項
1）    由于Calcein-AM對濕度非常敏感，若是Calcein-AM溶液每次取完需要量后，必須緊緊密封蓋子。建議根據單次用量，分裝密封保存。Calcein-AM工作液必須現配現用。
2）   典化丙啶（PI）有一定的致癌性，操作時一定要注意防護。若接觸到皮膚，需要立即用自來水清洗。
3）    為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用方法【詳見懋康maokangbio】
一、試劑準備
1.1 1×反應緩沖液（Assay Buffer）的配制
從低溫冰箱內取出10×Assay Buffer，根據單次用量無菌條件取出適量，用去離子水（dH₂O）做10倍稀釋以得到1×Assay Buffer。
1.2    1×染色工作液（Stain Buffer）的配制
1）   先將低溫保存的Calcein AM溶液 (4 mM)和PI溶液（1.5 mM）室溫回溫至少20min，使其充分融化。【注意：*次使用時建議對儲存液根據單次用量分裝，特別是Calcein AM，以減少反復凍融次數。】
二、染色步驟

常見問題【詳見懋康maokangbio】
1、   該試劑盒適用任何細胞類型？
基本上適用于任何含酯酶活性的動物細胞。植物和細菌細胞因含有細胞壁，Calcein-AM不能進入因此無法染色。有可能對原生質體進行染色。
2、   用相同濃度有可能對所有哺乳動物細胞進行染色？
對所有細胞都用相同的濃度是很不合理的。Calcein-AM和PI的zui加工作濃度根據細胞類型差異很大。有必要根據具體細胞來確定zui價染料濃度。參考說明書染料工作濃度優化方法。
3、   Calcein-AM對細胞有毒？
與其他相似的活細胞染料比較，Calcein-AM基本無毒（毒性zui小）。見文獻EL.S.D.Clerck,et.al., J.Immunol.Methods, 172,115-124(1994)
4、   試劑盒如何保存？
密封-20℃保存。Calcein-AM遇潮會水解，因此直至管子溫度達到室溫后才能開蓋。使用后擰緊蓋子。用緩沖液或者培養基稀釋后的染色工作液需即刻使用。不能保存后使用。

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 — —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】
 
 
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