Caspase-3 Activity Assay Kit (Colorimetric)  

Caspase-3活性檢測試劑盒（比色法）

產品信息

產品描述

Caspases（Cysteine-requiringAspartate Proteases）是一個(ge)高(gao)度(du)保守的(de)半胱an酸蛋(dan)白酶(mei)(mei)家族，特異性識(shi)別底物(wu)中(zhong)的(de)天(tian)冬氨酸殘基，在介(jie)導細(xi)(xi)胞(bao)凋亡(wang)的(de)過程中(zhong)發(fa)揮著非常(chang)重要的(de)作用。Caspases以潛在酶(mei)(mei)原的(de)形式表達，通過自發(fa)蛋(dan)白分(fen)解機制或經其他(ta)蛋(dan)白酶(mei)(mei)（通常(chang)是其他(ta)caspases）加工處理的(de)方(fang)式被活化。人(ren)caspases可細(xi)(xi)分(fen)為三大(da)功能組：細(xi)(xi)胞(bao)因(yin)子活化（caspase-1，-4，-5和(he)-13），凋亡(wang)啟動（caspase-2，-8，-9和(he)-10）和(he)凋亡(wang)執行（caspase-3，-6和(he)-7）。

Caspase-2（Caspase 2），也稱為(wei)(wei)Nedd2、ICH-1，含(han)核(he)定位所依賴的(de)(de)長前(qian)肽結構域(yu)的(de)(de)一類caspase。一旦凋亡通路被(bei)激(ji)活(huo)，caspase酶原在(zai)Asp316位上被(bei)切割生(sheng)(sheng)成一個(ge)14kDa片段(duan)和(he)一個(ge)32kDa的(de)(de)前(qian)肽結構域(yu)/大亞(ya)(ya)基(ji)。接下來在(zai)Asp152和(he)Asp330被(bei)切割，進一步生(sheng)(sheng)成18kDa大亞(ya)(ya)基(ji)和(he)12kDa小片段(duan)。Caspase-2是應(ying)對(dui)基(ji)因毒性應(ying)激(ji)或有絲分(fen)裂障礙的(de)(de)核(he)凋亡反應(ying)物。一旦招募生(sheng)(sheng)成含(han)p53誘導死亡結構域(yu)蛋(dan)白(bai)-PIDD的(de)(de)復合(he)物，caspase 2被(bei)激(ji)活(huo)。因此，Caspase-2被(bei)認為(wei)(wei)是核(he)啟動(dong)caspase，并且(qie)在(zai)下游的(de)(de)凋亡途徑(jing)中需要激(ji)活(huo)caspase-9和(he)caspase-3。

Caspase-3活性檢測試劑盒（比色(se)法(fa)）（Caspase-3 Activity Assay Kit, Colorimetric or Caspase-3 Colorimetric Assay Kit）以(yi)偶聯上發(fa)色(se)基團pNA的caspase-3序(xu)列特異性的多肽為(wei)底物。當底物被(bei)(bei)caspase-3剪切后，發(fa)色(se)基團被(bei)(bei)釋(shi)放出來，進而用(yong)酶(mei)標儀(yi)或分光(guang)(guang)光(guang)(guang)度(du)計(ji)來測定其吸(xi)光(guang)(guang)值（λ=405nm或400nm）。通過計(ji)算(suan)OD凋亡(wang)誘(you)導(dao)組(zu)/OD陰性對照(zhao)組(zu)的比值來確定凋亡(wang)誘(you)導(dao)組(zu)caspase-3的活化程度(du)。

本品適(shi)用于培養細胞(bao)以及新鮮組織(zhi)的caspase-3活性(xing)檢測。

產品包裝

保存與運輸方法

保(bao)存(cun)(cun)(cun)：-20℃保(bao)存(cun)(cun)(cun)，1年有(you)效(xiao)。開盒(he)后置(zhi)Lysis Buffer和2× Reaction Buffer于(yu)2-8℃保(bao)存(cun)(cun)(cun)。Caspase-3 Substrate和0.1M DTT需要(yao)避光凍(dong)存(cun)(cun)(cun)。

運輸：冰袋運輸。

注意事項

1） Caspase-3 Substrate需避光(guang)保存和使(shi)用。

2） 某些凋亡(wang)誘(you)導劑誘(you)導的凋亡(wang)可能通(tong)過(guo)caspase-3非依賴的方式進行，此種(zhong)情況使用本品(pin)檢測的caspase-3活性無明(ming)顯變化，則，需要考慮凋亡(wang)機制中(zhong)的其他信(xin)號通(tong)路。

3） 起始細胞數(shu)量(liang)需(xu)達3~5×106個或新鮮組織量(liang)達50~100mg，以保證達到測定所需(xu)的(de)(de)100~200μg蛋白量(liang)。Caspase-3的(de)(de)活性與細胞裂解后的(de)(de)蛋白含量(liang)有關，如(ru)測定的(de)(de)OD值偏低，可通過增加細胞數(shu)量(liang)或組織量(liang)的(de)(de)方法來提(ti)高(gao)蛋白量(liang)。

4） 優(you)先選擇測(ce)定(ding)λ=405nm的(de)吸光值；如有困難，再測(ce)定(ding)λ=400nm的(de)吸光值。

5） 為了您的安(an)全(quan)和(he)健康(kang)，請穿(chuan)實驗服并戴一(yi)次性手套操作。

使用方法

1.需要的其他試劑和材料

儀器：低(di)溫(wen)高速(su)離心機、酶標儀或分(fen)光光度計（100μl的比色皿(min)）（λ=405nm或400nm）、微量移液器、玻璃勻漿器（組織樣(yang)本）

耗材：1.5ml微量(liang)離心(xin)管(guan)、96孔酶標板（透明）或100μl的比色皿

試(shi)劑(ji)：PBS、蛋白定量試(shi)劑(ji)（比如：Bradford法蛋白濃(nong)度測(ce)定試(shi)劑(ji)盒(he)）

2.試劑準備

2.1 Lysis Buffer（含DTT）

于實驗(yan)前，按每50μl Lysis Buffer 加入(ru)0.5μl DTT的比例準備足量的裂解工作液(ye)，置于4℃或冰上待用。

2.2 2×Reaction Buffer（含DTT）

于(yu)使用前(qian)，按每50μl 2×Reaction Buffer 加(jia)入0.5μl DTT的(de)(de)比例準備足量的(de)(de)反(fan)應工作液。

3.樣本準備

3.1 細胞(bao)裂解(jie)

a）用合適方法(fa)誘(you)導(dao)(dao)細胞(bao)凋亡，同時設立陰性對(dui)照組（不加誘(you)導(dao)(dao)劑），收(shou)集3~5×106個(ge)細胞(bao)。

b）PBS洗滌(di)細(xi)胞2次（2000rpm，離心5min），盡量吸盡PBS上清。

c）往(wang)離心的沉(chen)淀細胞中加入15~200μl預冷(leng)的Lysis Buffer（含DTT），吹(chui)打混勻。

d）置冰(bing)上裂解20~60min，其(qi)間(jian)渦旋振蕩3~4次(ci)(ci)，每次(ci)(ci)10s；或凍融2~3次(ci)(ci)。

e）4℃，10,000rpm離(li)心1min。

f）小(xiao)心吸取上(shang)清（含裂(lie)解釋放的蛋白(bai)質）轉移到新的EP管內，置于冰(bing)上(shang)待用。

g）取少量(liang)上清（1~2μl），用(yong)常規方法（Bradford法）測定(ding)蛋白濃度。

3.2 組織(zhi)裂解

a）取50~100mg組(zu)織(zhi)置于培(pei)養皿內，用(yong)手術(shu)剪剪碎成3mm×3mm左右的(de)(de)小塊，加入150~200μl預冷的(de)(de)Lysis Buffer（含DTT），用(yong)玻(bo)璃勻(yun)(yun)漿(jiang)器上下手動勻(yun)(yun)漿(jiang)15次，注(zhu)意(yi)低溫操作。

b）將組織(zhi)勻漿液轉移到1.5ml預冷的離心管，10,000rpm，4℃離心5min。

c）小心吸取(qu)上(shang)清（含裂解(jie)釋(shi)放的蛋白質）轉移到新(xin)的EP管(guan)內，置于冰上(shang)待用。

d）取少量上清（1~2μl），用常規方法(fa)（Bradford法(fa)）測(ce)定蛋白濃度。

4.Caspase-3活性檢測

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